1、收集：用18號穿刺器穿刺術(shù)，20ml注射器（含有肝素2000u）在髂前上棘抽取骨髓10ml。抽取骨髓時(shí)留意維持針管斜坡在骨髓內(nèi)。快速抽取骨髓并使其和肝素勻稱，避免造成血塊。

2、分離純化：經(jīng)1200rpm離心10min，吸除頂層脂肪細(xì)胞，清洗三次。在骨髓中引入相對密度為1.073Percoll分離出來液。室內(nèi)溫度下3000g離心30min，有核細(xì)胞在分頁面及頂層液態(tài)中，紅細(xì)胞絕大多數(shù)在沉積中。用二倍容積的PBS稀釋液，并再度離心。將細(xì)胞重懸在少糖10%DMEM FBS細(xì)胞培養(yǎng)液中。調(diào)節(jié)細(xì)胞相對密度為1.6*106個(gè)/cm2注射于塑造瓶中。37℃，摩爾分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中塑造，72d后棄去未貼壁細(xì)胞，之后每3天換液一次。當(dāng)細(xì)胞匯聚90%單面細(xì)胞后，0.25%蛋白酶室內(nèi)溫度消化吸收傳代培養(yǎng)，離心（1000rpm，10min），棄上清，沉積按1：1占比傳代培養(yǎng)。

3、儲(chǔ)存：搜集生長發(fā)育優(yōu)良的細(xì)胞，取小量細(xì)胞混液（約0.1ml）記數(shù)細(xì)胞濃度值及凍前成活率。將細(xì)胞添加到含10%DMSO和30%血清蛋白的新鮮培養(yǎng)液中，用無菌檢測塑膠冷藏儲(chǔ)存管放進(jìn)到程序流程減溫盒中，于-70℃經(jīng)24h后轉(zhuǎn)到液態(tài)氮儲(chǔ)存。30d后，恢復(fù)細(xì)胞，用椎蟲藍(lán)上色檢驗(yàn)細(xì)胞活力，于37℃、摩爾分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫箱中塑造，每日顛倒顯微鏡下觀查細(xì)胞生長發(fā)育狀況（細(xì)胞生長發(fā)育情況及總數(shù)）。關(guān)鍵觀查指標(biāo)值：1）人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線圖剖析；2）細(xì)胞制冷機(jī)組恢復(fù)生長發(fā)育特點(diǎn)剖析。